Prirodnjačka zbirka Gradskog muzeja postoji još od 1892. godine, kada je osnovano Udruženje javne biblioteke (kasnije Udruženje javne biblioteke i muzeja). Prvenstveno su u sastav zbirke ulazili pokloni sugrađana koji su bili korišćeni za izložbenu aktivnost muzejskog udruženja. Među prvim značajnijim predmetima su bili lovački trofeji Oskara Vojnića, lovca i putopisca, koji su bili poklonjeni gradu za izložbu.

1901. godine napravljen je prvi popis, kada je 310 predmeta uneto u knjigu inventara. Najviše je bilo insekata, ptica i fosila. Na žalost iz vremena osnivanja muzeja samo je herbarij Ištvana Gurčana ostao sačuvan u celini, koji je napravljen 1902–1903 godine.

Danas prirodnjačka zbirka sadrži skoro 5000 predmeta, koji su svrstani u pet velikih tematskih jedinica: paleontološka, mineraloško-petrografska, zoološka, botanička i antropološka zbirka.

Paleontološka zbirka
Paleontološka zbirka sadrži mali broj predmeta, koji su uglavnom pronađeni u našoj okolini. Većinu njih čine fosili sisara iz doba pleistocena, npr. kosti runastog mamuta, stepskog bizona. Sem toga ima i biljnih fosila i fosila mekušaca i nekoliko vrsta ptica.

Mineraloško-petrografska zbirka
Muzej poseduje zbirku od skoro 100 predmeta, među njima su sedimentne stene, metamorfne stene i minerali.

Zoološka zbirka
U zoološkoj zbirci Gradskog muzeja ima oko 1000 predmeta, od kojih većinu čine kičmenjaci, manji deo beskičmenjaci (uglavnom insekti). Predmeti zbirke se mogu svrstati u dve grupe: većina njih pripada zoološkoj zbirci našeg regiona, dok manji deo čine lovački trofeji sa područja van Evrope.

Zoološka zbirka našeg regiona
Ova zbirka predstavlja životinjski svet Subotice i okoline. Većina predmeta su preparati ptica, najvećim delom sa vodenih staništa. Značajan deo predmeta je rađeno u vidu balgova u svrhu naučnih istraživanja (zbirka Aleksandra Rafajlovića). Manji deo zbrike predstavljaju dermoplastični preparati za potrebe izložbenih aktivnosti. Značajan deo zbirke čine entomološki preparati, koji broje više stotina primeraka. Manji deo zbirke čine preparati sisara, a to su uglavnom rogovi kao lovački trofeji. Pored toga, muzej ima i kolekciju ptičjih jaja i ptičjih gnezda.

Vanevropska zbirka lovačkih trofeja
Zoološka zbirka Gradskog muzeja sadrži i zbirku lovačkih trofeja sa područja van Evrope. Ta zbirka ima 100 predmeta i ona je jedinstvena u Srbiji i po broju predmeta i po raznovrsnosti životinjskih vrsta. Većinu trofeja u današnjoj zbirci je sakupio lovac i svetski putnik iz Novog Kneževca, Emil Talijan. Manji deo zbirke trofeja je bilo u vlasništvu zemljoposednika iz Bačke Topole Balinta Fernbaha. Predmeti su stigli u prirodnjačku zbirku subotičkog Gradskog muzeja nakon ukidanja rada Lovačkog muzeja na Paliću. Za manji deo zbirke se može pretpostaviti da je jedan deo stigao u Muzej konfiskacijom posle Drugog svetskog rata.

Botanička zbirka
Botanička zbirka Gradskog muzeja sadrži više od 2000 primeraka i ona je ujedno i najveća u okviru prirodnjačkog odeljenja. Najveći deo našeg botaničkog materijala je iz okoline Subotice, a bogatstvo vrsta se može objasniti time da na relativno malom prostoru postoje četiri različita biotopa (staništa): peščara, stepa na lesu, slatina, močvara i vlažne livade. U zbirci ima preparata i nižih i viših biljaka. Najveća jedinica botaničke zbirke je herbarijum dr Bele Šturca, koja obuhvata 594 vrste, podvrste i forme, u oko 1000 omota.

Fizičko antropološka zbirka
Fizičko antropološka zbirka sadrži ostatke ljudskih skeleta od oko 1500 pojedinaca sa više od 15 arheoloških nalazišta. Prvi nalazi su dospeli u muzej prilikom iskopavanja posle Drugog svetskog rata, a najviše predmeta je sakupljeno 1970-ih godina, kada je izvršeno plansko istraživanje i iskopavanje više nekropola (npr. Stara Moravica-Koplalo, Bačka Topola-Klanica). Zbirka obuhvata period od bakarnog doba do 16. veka naše ere. Najvećim delom se sastoji od predmeta sakupljenih na lokalitetima iz doba Avara, ali ima kostiju iz doba Arpadovića i iz poznog srednjeg veka.